[PCR]#12 장티푸스 PCR 실험

박아름
2021-06-25
조회수 361


목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

6. 관련 자료


1. 개요 및 목적  


1. 개요 및 목적

두 종류의 주요한 장티푸스 유전자를 증폭할 수 있는 primer set을 이용하여 장티푸스를 진단하는데 사용되는 중합효소 연쇄 반응 분석법이다.

2.실험 재료 및 기기


2. 실험 재료 및 기기

PCR PreMix, Primer set, 결핵균 DNA, Agaroge gel, TAE or TBE buffer, loading dye, DNA ladder (100bp)

  • Primer 정보
 Forward primer 1 GCT TAA TGT CCA AGA TGC CTA CAC
 Reverse primer 1 GAG CAA CGC CAG TAC CAT CTG
 Forward primer 2 CAC GCA CCA TCA TTT CAC CG
 Reverse primer 2  ACT AAC GGC CTA AAC GGG AT


  • 실험 기기

Conventional PCR (ex.DuxCycler-바이오메듀스,한국)

DNA Electrophoresis (ex.DuxGeldoc- 바이오메듀스,한국)


3. 실험 방법 및 절차


3. 실험 방법 및 절차

1) PCR 혼합액을 준비한다. PCR 혼합액은 검체 1개 기준으로 다음 표의 조성으로 각 시약을 혼합하여 준비 한다. 이때 각 시약의 사용량은 대조군(양성대조군, 음성대조군)을 포함한 검체의 반응수에 따라 필요한 양을 계산한다. 

첨가시약

용량(검체 1개 기준)

PCR PreMix

10 ㎕

Primer Mix

4 ㎕

D.W

3 ㎕

합계

17 ㎕

2) PCR 혼합액을 5회 정도 가볍게 섞어주거나 vortexing한 후 가볍게 원심분리한다.

3) PCR 튜브에 PCR 혼합액을 17 ㎕씩 분주한다. (분주 후에는 바로 뚜껑을 닫아 오염을 방지한다.)

4) 튜브에 임상검체에서 추출한 template DNA 3 ㎕를 첨가한다.

(양성대조군에는 제공되는 양성대조군 DNA를, 음성대조군에는 D.W를 첨가한다.)

첨가시약

용량(검체 1개 기준)

PCR 혼합액

17 ㎕

template DNA

3 ㎕

합계

20 ㎕


4) 각 혼합액 튜브는 30초간 원심분리 후, PCR 장치에 넣어 아래와 같이 반응시킨다. 

과 정

온 도

시 간

cycle 수

UDG treatment

37℃

2분

1

Pre-Denaturation

95℃

15분

1

Denaturation

95℃

30초

40

Annealing

58℃

1분

Extension

72℃

2분

Final-Extension

72℃

5분

1

End

4℃

 

5)PCR 산물 5 uL를 1-2% 아가로즈 겔에서 전기영동하여 확인한다.


4. 실험 결과

4. 실험 결과

-두개의 밴드 587bp, 484bp에서 모두 확인 시 양성으로 판단한다.


5. 주의 사항


5. 주의 사항

1) 실험 도중 DNA나 PCR 시약이 오염되지 않도록 파이펫팅에 주의를 기울인다.

2) 실험 방법 중 온도나 시약 양을 틀리지 않게 주의하여 실험한다.


#장티푸스 #DNA # UDG system #PCR







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