[PCR]#14 SARS-CoV-2 (N gene)를 이용한 역전사중합효소(RT-PCR) 반응

이농
2021-10-08
조회수 28


목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

6. 관련 자료


1. 개요 및 목적  

1. 개요 및 목적

SARS-CoV-2의 검출을 위한 후보 유전자로 ORF1/RdRp,N,E,S gene 등이 있다. 이 유전자 중 N gene 을 Target으로 RT-PCR (reverse transcription PCR) 기법을 공부하고자 한다.

RT-PCR을 진행하는 이유는 코로나 바이러스의 유전체는 DNA가 아닌 RNA이기 때문이다.

단일가닥의 RNA는 이중가닥의 DNA보다 불안정하고, RNA를 증폭할 수 없기 때문에 RNA-dependent DNA Polymerase라는 효소를 사용하여 안정적인 DNA로 역전사하는 과정이 필요하다.

역전사를 통해 만들어진  DNA를 cDNA(complementary DNA)라고 한다.

2.실험 재료 및 기기


2. 실험 재료 및 기기

ㅅ3. 실험 방법 및ㅅ 절차

실험재료

- 2x reaction mix [Hot-Taq] (dNTP mix, MgCl2 포함)

- Enzyme Mix [Hot-Taq]

- Forward Primer (TGGACCCCAAAATCAGCG:18mer)

- Reverse Primer (GCCTTGTCCTCGAGGGAAT:19mer)

- Template (RNA)

  : N gene Positive Control (NEB사)

- D.W

- 100bp DNA Ladder


실험 기기

- Conventrional PCR (본 실험에서 사용한 기기 → DuxCycler (주)바이오메듀스, 한국)

- 전기영동 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → Power Supply - BIO-RAD, 미국 / gel tray-(주)바이오니아, 한국) 

- Gel 이미지 영상처리 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → DuxGelDoc - (주)바이오메듀스,한국) 


3. 실험 방법 및 절차

4. ㅅ실험 결과

1) 실험재료를 이용하여 PCR Mixture를 준비한다.

 0.2ml PCR tube에 아래 표의 용량대로 섞는다.


PCNC
2x reaction mix [Hot-Taq]10 uL10 uL
Enzyme Mix [Hot-Taq] 1 uL1 uL
Forward Primer1 uL1 uL
Reverse Primer1 uL1 uL
Template3 uL-
D.W4 uL7 uL


2) 아래 표의 PCR 조건을 기기에 설정하고 PCR을 진행한다. (Running time: 약 1시간30분)

단계온도시간반복
cDNA 합성50 도15 분1
초기변성95 도5 분1
변성95 도20 초35
결합50 도40 초
신장72 도30 초
최종신장72 도5 분1
4 도*

* PCR이 끝난 후 산물이 변성없이 제일 안정적으로 유지될 수 있는 온도입니다. 


3) PCR이 끝나면 기기로 부터 tube를 꺼내, 전기영동장치를 이용하여 PCR 증폭 산물을 확인한다.

 → 실험 레시피 : 아가로스 겔(agarose gel) 만들기 / 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동법 게시글 참고!


4. 실험 결과



M : 100bp DNA Ladder

1  : PC (1X103 copy/ul) product size : 202bp

2  : NC

2% Agarose gel 사용

→ 실험결과 이미지 (DuxGeldoc :(주)바이오메듀스,한국)


<결과에 대한 설명>

PC(Positive Control)에서 202bp 의 band가 형성되었는지 확인한다.

band가 없을 경우, PCR 과정 중 오류로 의심할 수 있으며, 재시험을 진행한다. 

NC(Negative Control)에서 band가 형성되지 않아야 한다.

band가 확인된다면  PCR 과정에 사용된 시약의 오염을 의심할 수 있으며, 이 경우 PCR에 사용되는 시약을 모두 바꾼 후 재시험을 진행한다.

   

5. 주의 사항

 


5. 주의 사항

- 실험재료는 정해진 보관조건에 따라 -20도 냉동고에서 보관한다.

- 모든 시약은 실험을 시작하기 전 충분히 녹여 사용한다.

- 유효기간이 지난 제품은 사용하지 않는다.

- 실험 과정 중 오염에 주의한다.

6. 관련 자료

6. 관련 자료

- 없음


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* 본 실험에 사용된 SARS-CoV-2 유전체를 이용한 RT-PCR 실험은 (주)바이오메듀스의 교육용 PCR Kit를 사용했습니다.






김인영


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