1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
사람의 구강상피세포, 모근, 소변 등 여러 시료에 대하여 DNA 추출을 하며 DNA의 기본적인 추출과정과 원리에 대해 배울 수 있다.
이렇게 추출된 DNA는 사람의 미토콘드리아내의 매우 보존적인 염기서열을 갖고 있는 16SrRNA를 이용하여 증폭실험을 진행하며,
그 결과를 전기영동 실험을 통해 확인한다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
실험재료
-Sample Preparation solution
-2X PCR Master mix
-16SrRNA Forward primer (CAATTGGACCAATCTATCACC:21mer)
-16SrRNA Reverse primer (GTGAGGGTAATAATGACTTGT:21mer)
-추출된 DNA
-Positive DNA
-D.W
-50bp DNA Ladder
실험기기
- Conventrional PCR (본 실험에서 사용한 기기 → DuxCycler (주)바이오메듀스, 한국)
- 전기영동 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → Power Supply - BIO-RAD, 미국 / gel tray-(주)바이오니아, 한국)
- Gel 이미지 영상처리 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → DuxGelDoc - (주)바이오메듀스,한국)
- Heat block (본 실험에서 사용한 기기 → Allsheng Instrument)
3. 실험 방법 및 절차
3. 실험 방법 및 절차
< 시료 채취 >
구강상피세포: 식염수로 1분정도 입안을 강하게 헹궈서 구강상피세포를 추출하여 1ml tube에 담아준다.
모근: 머리카락을 몇가닥 뽑아 모근의 부분만 tube에 모아준다.
소변: 종이컵에 소변을 받아 1ml tube에 넣어준다.
<DNA 추출 >
1. 원심분리기의 최대속도로 1분간 원심분리한 후 약간의 용액만 남기고 상층액을 버려준다.
(모근의 경우 이 과정을 생략)
2. 시료전처리액을 각 50ul씩 넣어 볼텍스믹서를 통해 수초간 섞어준다.
3. 원심분리기로 tube 벽면의 시료를 바닥으로 떨어뜨린 후 핫블럭이나 PCR기기를 통해 95℃, 10분간 처리해준다.
4. 처리한 시료를 원심분리기 최대속도로 1분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담는다.
(마지막 과정이 번거롭다면 원심분리를 생략하고 시료의 위부분을 살짝 따서 사용하여도 좋다)
<DNA 증폭 실험>
1. 샘플 준비
| 번호 | 시약명 | Tube1 | Tube2 (PC) | Tube3 (NC) |
| 1 | 2X PCR Master mix | 10ul | 10ul | 10ul |
| 2 | Forward primer | 1ul | 1ul | 1ul |
| 3 | Reverse primer | 1ul | 1ul | 1ul |
| 4 | 추출 DNA | 3ul | - | - |
| 5 | Positive DNA | - | 3ul | - |
| 6 | D.W | 5ul | 5ul | 8ul |
| Total | 20ul | 20ul | 20ul |
*PC는 Positive Control (양성대조군), NC는 Negative Control (음성대조군)을 말한다.
2. PCR 조건
| 단계 | 온도 | 시간 | 반복 사이클 |
| 초기 변성 | 95도 | 5:00 | 1 |
| 변성 | 95도 | 0:20 | 30 |
| 결합 | 54도 | 0:20 |
| 신장 | 72도 | 0:30 |
| 최종 신장 | 72도 | 5:00 | 1 |
| 4도 | ∞ |
|
<전기영동>
1. 완충용액(TAE or TBE buffer)이 담긴 전기영동 탱크에 준비된 Agarose gel을 설치한다.
2. 증폭된 DNA 산물 5㎕, 6X loading dye 1㎕를 혼합하여 Micropipette으로 Agarose gel 주입 홈(well)안에 주입한다.
3. 한 well에는 상품화된 DNA size marker(DNA Ladder)를 주입하여, DNA band의 크기를 비교 확인 할 수 있다.
4. power supply를 연결하여 250v에서 ⊝→⊕ 방향으로 전기를 걸어준다.
(DNA 밴드가 gel의 약 2/3 지점까지 끌리면 멈춘다)
5. 전기영동된 gel을 nucleic acid stain 처리를 한다.(Loading star 사용 시 증폭산물과 혼합하여 Agarose gel well에 주입하여 전기영동 하므로 이 단계를 생략한다.)
(보통 EtBr 용액에 약 20분간 넣어두지만 EtBr이 인체에 유해하므로 대체상품(권장상품: Loading Star(제조사: DyneBio))을 사용할 것을 권장한다.)
6. Gel-Doc 시스템을 사용하여 band를 확인한다.
4. 실험 결과
4. 실험 결과
-M: 50bp Ladder
-1~5: 소변에서 추출한 DNA (16SrRNA: 157bp)
-6~10: 머리카락에서 추출한 DNA
-11~15: 구강세포에서 추출한 DNA
-P: Positive Control
-N: Negative Control
*사람마다 추출된 DNA의 양이 다르므로 밴드의 두께가 다 다를 수 있다.
5. 주의 사항
5. 주의 사항
- 음성대조군에 밴드 형성: 실험 도구 및 테이블을 소독하여 오염원을 제거한다.
- 맞지 않는 위치에 밴드 형성: 잘못된 실험이므로 다시 실험을 진행한다.
6. 관련 자료
#Conventional PCR #16SrRNA gene #구강상피세포
* 본 실험에 사용된 Human DNA 추출, 증폭 실험은 (주)바이오메듀스의 교육용 PCR Kit를 사용했습니다.
이경진
경기도 수원시 영통구 대학4로 17 (이의동) 에이스광교타워1 3층 308호
Tel.(+82)031-899-8620 Fax.(+82)031-899-8621
E-mail. leekj87@biomedux.com
목차
1.개요 및 목적
2. 실험 재료 및 기기
3. 실험 방법 및 절차
4. 실험 결과
5. 주의 사항
1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
사람의 구강상피세포, 모근, 소변 등 여러 시료에 대하여 DNA 추출을 하며 DNA의 기본적인 추출과정과 원리에 대해 배울 수 있다.
이렇게 추출된 DNA는 사람의 미토콘드리아내의 매우 보존적인 염기서열을 갖고 있는 16SrRNA를 이용하여 증폭실험을 진행하며,
그 결과를 전기영동 실험을 통해 확인한다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
실험재료
-Sample Preparation solution
-2X PCR Master mix
-16SrRNA Forward primer (CAATTGGACCAATCTATCACC:21mer)
-16SrRNA Reverse primer (GTGAGGGTAATAATGACTTGT:21mer)
-추출된 DNA
-Positive DNA
-D.W
-50bp DNA Ladder
실험기기
- Conventrional PCR (본 실험에서 사용한 기기 → DuxCycler (주)바이오메듀스, 한국)
- 전기영동 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → Power Supply - BIO-RAD, 미국 / gel tray-(주)바이오니아, 한국)
- Gel 이미지 영상처리 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → DuxGelDoc - (주)바이오메듀스,한국)
- Heat block (본 실험에서 사용한 기기 → Allsheng Instrument)
3. 실험 방법 및 절차
3. 실험 방법 및 절차
< 시료 채취 >
구강상피세포: 식염수로 1분정도 입안을 강하게 헹궈서 구강상피세포를 추출하여 1ml tube에 담아준다.
모근: 머리카락을 몇가닥 뽑아 모근의 부분만 tube에 모아준다.
소변: 종이컵에 소변을 받아 1ml tube에 넣어준다.
<DNA 추출 >
1. 원심분리기의 최대속도로 1분간 원심분리한 후 약간의 용액만 남기고 상층액을 버려준다.
(모근의 경우 이 과정을 생략)
2. 시료전처리액을 각 50ul씩 넣어 볼텍스믹서를 통해 수초간 섞어준다.
3. 원심분리기로 tube 벽면의 시료를 바닥으로 떨어뜨린 후 핫블럭이나 PCR기기를 통해 95℃, 10분간 처리해준다.
4. 처리한 시료를 원심분리기 최대속도로 1분간 원심분리한 후 상층액을 새로운 튜브에 옮겨 담는다.
(마지막 과정이 번거롭다면 원심분리를 생략하고 시료의 위부분을 살짝 따서 사용하여도 좋다)
<DNA 증폭 실험>
1. 샘플 준비
*PC는 Positive Control (양성대조군), NC는 Negative Control (음성대조군)을 말한다.
2. PCR 조건
<전기영동>
1. 완충용액(TAE or TBE buffer)이 담긴 전기영동 탱크에 준비된 Agarose gel을 설치한다.
2. 증폭된 DNA 산물 5㎕, 6X loading dye 1㎕를 혼합하여 Micropipette으로 Agarose gel 주입 홈(well)안에 주입한다.
3. 한 well에는 상품화된 DNA size marker(DNA Ladder)를 주입하여, DNA band의 크기를 비교 확인 할 수 있다.
4. power supply를 연결하여 250v에서 ⊝→⊕ 방향으로 전기를 걸어준다.
(DNA 밴드가 gel의 약 2/3 지점까지 끌리면 멈춘다)
5. 전기영동된 gel을 nucleic acid stain 처리를 한다.(Loading star 사용 시 증폭산물과 혼합하여 Agarose gel well에 주입하여 전기영동 하므로 이 단계를 생략한다.)
(보통 EtBr 용액에 약 20분간 넣어두지만 EtBr이 인체에 유해하므로 대체상품(권장상품: Loading Star(제조사: DyneBio))을 사용할 것을 권장한다.)
6. Gel-Doc 시스템을 사용하여 band를 확인한다.
4. 실험 결과
4. 실험 결과
-M: 50bp Ladder
-1~5: 소변에서 추출한 DNA (16SrRNA: 157bp)
-6~10: 머리카락에서 추출한 DNA
-11~15: 구강세포에서 추출한 DNA
-P: Positive Control
-N: Negative Control
*사람마다 추출된 DNA의 양이 다르므로 밴드의 두께가 다 다를 수 있다.
5. 주의 사항
5. 주의 사항
- 음성대조군에 밴드 형성: 실험 도구 및 테이블을 소독하여 오염원을 제거한다.
- 맞지 않는 위치에 밴드 형성: 잘못된 실험이므로 다시 실험을 진행한다.
6. 관련 자료
#Conventional PCR #16SrRNA gene #구강상피세포
* 본 실험에 사용된 Human DNA 추출, 증폭 실험은 (주)바이오메듀스의 교육용 PCR Kit를 사용했습니다.
이경진
경기도 수원시 영통구 대학4로 17 (이의동) 에이스광교타워1 3층 308호
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