[PCR]#9 뎅기열바이러스(Dengue virus) PCR 실험

박아름
2021-05-26
조회수 470


목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

1. 개요 및 목적  


1. 개요 및 목적

뎅기열은 뎅기 바이러스를 가지고 있는 모기가 사람을 무는 과정에서 사람에게 감염되어 생기는 병으로 고열을 동반하는 급성 열성 질환이다.

갑작스럽게 고열이 나서 발열은 3~5일간 계속되고, 심한 두통, 근육통, 관절통, 식욕부진이 생긴다. 초기에 때로 신체 전반에 붉은 반점이 나타난다. 열이 떨어지면서 온 몸에 피부 발진이 1~5일간 계속되는데, 초기에는 얼굴, 목 및 가슴 부위에 좁쌀 모양의 발진이 일시적으로 나타나다가 3~4일째에 가슴과 몸통에서 시작하여 팔다리와 얼굴로 퍼지게 된다. 코피나 잇몸 출혈 등의 경미한 출혈이 질병 경과 중에 나타난다. 성인의 경우 혈변을 보거나 월경과다, 목 부위의 림프절이 붓는 증상이 나타나기도 한다.

뎅기 바이러스를 감지하는데 사용되는 역전사 중합효소 연쇄반응 분석법이다. 뎅기 의심환자 혈청에서 뎅기 바이러스의 RNA를 추출하여 역전사 반응을 통해 뎅기 바이러스의 핵산을 합성한 후 , 1개의 정방향 프라이버와 4개의 역방향 프라이버 쌍을 이용하여 중합효소 연쇄 반응을 일으켜 증폭함으로써 4가지 type의 뎅기 바이러스를 확인하게 된다.

2.실험 재료 및 기기


2. 실험 재료 및 기기

실험 재료

2X buffer, Enzyme Mix, Primer Mix, Dengue RNA(뎅기열 바이러스 RNA), Agaroge gel, TAE or TBE buffer, loading dye, DNA ladder (100bp)

  • Primer 정보
 Forward primer TCA ATA TGC TGA AAC GCG CGA GAA ACC G
 Reverse primer (Type1) CGC TCC ATT CTT CTT GAA TGA GC
 Reverse primer (Type2) CGC CAC AAG GGC CAT GAA CAG
 Reverse primer (Type3) TAA CAT CAT CAT GAG ACA GAG C
 Reverse primer (Type4) TGT TGT CTT AAA CAA GAG AGG TC


실험 기기

Conventional PCR (ex.DuxCycler-바이오메듀스)

DNA Electrophoresis (ex.DuxGeldoc- 바이오메듀스,한국)

3. 실험 방법 및 절차


3. 실험 방법 및 절차

1) RT-PCR을 위한 반응 Tube의 조성은 다음과 같다. (검체 1개 기준)

첨가시약

Tube

Template RNA

4 ㎕

2X buffer

10 ㎕

enzyme mix

1 ㎕

primer mix

5 ㎕

합계

20 ㎕


2) Template RNA를 제외한 위 2X buffer, enzyme mix, primer mix 를 test 할 개수+1 만큼 섞어서 PCR tube 에 16 ㎕ 씩 넣는다.

3) 위 튜브에 추출한 template RNA 4 ㎕를 첨가한다.

4) 각 혼합액 튜브는 30초간 spin down 후, PCR 장치에 넣어 아래와 같이 반응시킨다.


과 정

온 도

시 간

cycle 수

cDNA Synthesis

50℃

30분

1

Pre-Denaturation

95℃

15분

1

Denaturation

95℃

30초

40

Annealing

60℃

30초

Extension

72℃

1분

Final-Extension

72℃

5분

1

End

4℃

 

 

 4. 실험 결과


4. 실험 결과


유전형

PCR 증폭산물 크기

1형 (type 1)

190 bp

2형 (type 2)

119 bp

3형 (type 3)

290 bp

4형 (type 4)

389 bp

5. 주의 사항


5. 주의 사항

1) 실험 도중 DNA나 PCR 시약이 오염되지 않도록 파이펫팅에 주의를 기울인다.

2) 실험 방법 중 온도나 시약 양을 틀리지 않게 주의하여 실험한다.


#Dengue virus #뎅기열 #RNA # reverse-transcription PCR 




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