1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
SARS-CoV-2의 검출을 위한 후보 유전자로 ORF1/RdRp,N,E,S gene 등이 있다. 이 유전자 중 N gene 을 Target으로 RT-PCR (reverse transcription PCR) 기법을 공부하고자 한다.
RT-PCR을 진행하는 이유는 코로나 바이러스의 유전체는 DNA가 아닌 RNA이기 때문이다.
단일가닥의 RNA는 이중가닥의 DNA보다 불안정하고, RNA를 증폭할 수 없기 때문에 RNA-dependent DNA Polymerase라는 효소를 사용하여 안정적인 DNA로 역전사하는 과정이 필요하다.
역전사를 통해 만들어진 DNA를 cDNA(complementary DNA)라고 한다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
ㅅ3. 실험 방법 및ㅅ 절차
실험재료
- 2x reaction mix [Hot-Taq] (dNTP mix, MgCl2 포함)
- Enzyme Mix [Hot-Taq]
- Forward Primer (TGGACCCCAAAATCAGCG:18mer)
- Reverse Primer (GCCTTGTCCTCGAGGGAAT:19mer)
- Template (RNA)
: N gene Positive Control (NEB사)
- D.W
- 100bp DNA Ladder
실험 기기
- Conventrional PCR (본 실험에서 사용한 기기 → DuxCycler (주)바이오메듀스, 한국)
- 전기영동 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → Power Supply - BIO-RAD, 미국 / gel tray-(주)바이오니아, 한국)
- Gel 이미지 영상처리 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → DuxGelDoc - (주)바이오메듀스,한국)
3. 실험 방법 및 절차
4. ㅅ실험 결과
1) 실험재료를 이용하여 PCR Mixture를 준비한다.
0.2ml PCR tube에 아래 표의 용량대로 섞는다.
| PC | NC |
| 2x reaction mix [Hot-Taq] | 10 uL | 10 uL |
| Enzyme Mix [Hot-Taq] | 1 uL | 1 uL |
| Forward Primer | 1 uL | 1 uL |
| Reverse Primer | 1 uL | 1 uL |
| Template | 3 uL | - |
| D.W | 4 uL | 7 uL |
2) 아래 표의 PCR 조건을 기기에 설정하고 PCR을 진행한다. (Running time: 약 1시간30분)
| 단계 | 온도 | 시간 | 반복 |
| cDNA 합성 | 50 도 | 15 분 | 1 |
| 초기변성 | 95 도 | 5 분 | 1 |
| 변성 | 95 도 | 20 초 | 35 |
| 결합 | 50 도 | 40 초 |
| 신장 | 72 도 | 30 초 |
| 최종신장 | 72 도 | 5 분 | 1 |
| 끝 | 4 도* | ∞ |
|
* PCR이 끝난 후 산물이 변성없이 제일 안정적으로 유지될 수 있는 온도입니다.
3) PCR이 끝나면 기기로 부터 tube를 꺼내, 전기영동장치를 이용하여 PCR 증폭 산물을 확인한다.
→ 실험 레시피 : 아가로스 겔(agarose gel) 만들기 / 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동법 게시글 참고!
4. 실험 결과
M : 100bp DNA Ladder
1 : PC (1X103 copy/ul) product size : 202bp
2 : NC
2% Agarose gel 사용
→ 실험결과 이미지 (DuxGeldoc :(주)바이오메듀스,한국)
<결과에 대한 설명>
PC(Positive Control)에서 202bp 의 band가 형성되었는지 확인한다.
band가 없을 경우, PCR 과정 중 오류로 의심할 수 있으며, 재시험을 진행한다.
NC(Negative Control)에서 band가 형성되지 않아야 한다.
band가 확인된다면 PCR 과정에 사용된 시약의 오염을 의심할 수 있으며, 이 경우 PCR에 사용되는 시약을 모두 바꾼 후 재시험을 진행한다.
5. 주의 사항
5. 주의 사항
- 실험재료는 정해진 보관조건에 따라 -20도 냉동고에서 보관한다.
- 모든 시약은 실험을 시작하기 전 충분히 녹여 사용한다.
- 유효기간이 지난 제품은 사용하지 않는다.
- 실험 과정 중 오염에 주의한다.
6. 관련 자료
6. 관련 자료
- 없음
#Revers transriptation PCR #RT-PCR #역전사중합효소연쇄반응 #RT-PCR원리 #Conventional PCR #SARS-CoV-2 #Ngene #Electrophoresis
* 본 실험에 사용된 SARS-CoV-2 유전체를 이용한 RT-PCR 실험은 (주)바이오메듀스의 교육용 PCR Kit를 사용했습니다.
김인영
경기도 수원시 영통구 대학4로 17 (이의동) 에이스광교타워1 3층 308호
Tel.(+82)031-899-8620 Fax.(+82)031-899-8621
E-mail. iykim@biomedux.com
목차
1.개요 및 목적
2. 실험 재료 및 기기
3. 실험 방법 및 절차
4. 실험 결과
5. 주의 사항
6. 관련 자료
1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
SARS-CoV-2의 검출을 위한 후보 유전자로 ORF1/RdRp,N,E,S gene 등이 있다. 이 유전자 중 N gene 을 Target으로 RT-PCR (reverse transcription PCR) 기법을 공부하고자 한다.
RT-PCR을 진행하는 이유는 코로나 바이러스의 유전체는 DNA가 아닌 RNA이기 때문이다.
단일가닥의 RNA는 이중가닥의 DNA보다 불안정하고, RNA를 증폭할 수 없기 때문에 RNA-dependent DNA Polymerase라는 효소를 사용하여 안정적인 DNA로 역전사하는 과정이 필요하다.
역전사를 통해 만들어진 DNA를 cDNA(complementary DNA)라고 한다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
ㅅ3. 실험 방법 및ㅅ 절차
실험재료
- 2x reaction mix [Hot-Taq] (dNTP mix, MgCl2 포함)
- Enzyme Mix [Hot-Taq]
- Forward Primer (TGGACCCCAAAATCAGCG:18mer)
- Reverse Primer (GCCTTGTCCTCGAGGGAAT:19mer)
- Template (RNA)
: N gene Positive Control (NEB사)
- D.W
- 100bp DNA Ladder
실험 기기
- Conventrional PCR (본 실험에서 사용한 기기 → DuxCycler (주)바이오메듀스, 한국)
- 전기영동 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → Power Supply - BIO-RAD, 미국 / gel tray-(주)바이오니아, 한국)
- Gel 이미지 영상처리 장치 (본 실험에서 사용한 기기 → DuxGelDoc - (주)바이오메듀스,한국)
3. 실험 방법 및 절차
4. ㅅ실험 결과
1) 실험재료를 이용하여 PCR Mixture를 준비한다.
0.2ml PCR tube에 아래 표의 용량대로 섞는다.
2) 아래 표의 PCR 조건을 기기에 설정하고 PCR을 진행한다. (Running time: 약 1시간30분)
* PCR이 끝난 후 산물이 변성없이 제일 안정적으로 유지될 수 있는 온도입니다.
3) PCR이 끝나면 기기로 부터 tube를 꺼내, 전기영동장치를 이용하여 PCR 증폭 산물을 확인한다.
→ 실험 레시피 : 아가로스 겔(agarose gel) 만들기 / 아가로스 겔(agarose gel) 전기영동법 게시글 참고!
4. 실험 결과
M : 100bp DNA Ladder
1 : PC (1X103 copy/ul) product size : 202bp
2 : NC
2% Agarose gel 사용
→ 실험결과 이미지 (DuxGeldoc :(주)바이오메듀스,한국)
<결과에 대한 설명>
PC(Positive Control)에서 202bp 의 band가 형성되었는지 확인한다.
band가 없을 경우, PCR 과정 중 오류로 의심할 수 있으며, 재시험을 진행한다.
NC(Negative Control)에서 band가 형성되지 않아야 한다.
band가 확인된다면 PCR 과정에 사용된 시약의 오염을 의심할 수 있으며, 이 경우 PCR에 사용되는 시약을 모두 바꾼 후 재시험을 진행한다.
5. 주의 사항
5. 주의 사항
- 실험재료는 정해진 보관조건에 따라 -20도 냉동고에서 보관한다.
- 모든 시약은 실험을 시작하기 전 충분히 녹여 사용한다.
- 유효기간이 지난 제품은 사용하지 않는다.
- 실험 과정 중 오염에 주의한다.
6. 관련 자료
6. 관련 자료
- 없음
#Revers transriptation PCR #RT-PCR #역전사중합효소연쇄반응 #RT-PCR원리 #Conventional PCR #SARS-CoV-2 #Ngene #Electrophoresis
* 본 실험에 사용된 SARS-CoV-2 유전체를 이용한 RT-PCR 실험은 (주)바이오메듀스의 교육용 PCR Kit를 사용했습니다.
김인영
경기도 수원시 영통구 대학4로 17 (이의동) 에이스광교타워1 3층 308호
Tel.(+82)031-899-8620 Fax.(+82)031-899-8621
E-mail. iykim@biomedux.com