[Real Time PCR]#16 CT(Chlamydia trachomatis) amplification test

시애틀
2021-11-08
조회수 188

목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

1. 개요 및 목적


1. 개요 및 목적

     시약의 보관 기간에 따라서 증폭 결과에 영향이 있는지 확인하고자 하는 실험 

2. 실험 재료 및 기기


2. 실험 재료 및 기기

    1.  Reagents: TaqMan Gene expression master mix, Primer set (Forward, Reverse, *Probe), Chlamydia trachomatis DNA, Nuclease free water(Qiagen)

    ※ 프라이머, 프로브 서열은 #3 CT(Chlamydia trachomatis) 증폭 실험과 동일합니다.


    2. 실험 기기 : Real-time PCR (LightCycler 480 - Roche)

3. 실험 방법 및 절차


3. 실험 방법 및 절차

    1) Chlamydia trachomatis DNA(10^5 copy)를 10배, 100배 희석하여 준비한다. 

    2) 8-strip tube에 다음의 PCR sample 시약 조성에 따라 준비한 샘플을 주입한다.

ReagentsSamplesNegative control
Master mix15μL15μL 
Primer set7.5μL 7.5μL 
CT DNA4.5μL (농도별)-
Nuclease Free water
3μL 7.5μL 
Total30μL 30μL 


    3) PCR protocol 에 맞춰 기기를 세팅한다.

StepsTemperatureTimeCycle
Initial denaturation50℃02:001
Denaturation95℃10:001
Primers annealing 95℃00:1540
Elongation60℃01:00

  

    4) PCR이 끝나면 결과를 확인한다. 

4. 실험 결과


4. 실험 결과


  <Roche - LightCycler 480 Results>

        1) Sample에서 new로 표기된 것은, 입고 후 바로 소분하여 희석시켜서 사용한 시약

        2) Sample에서 old로 표기된 것은, 입고 후에 소분 후 냉동실에 1달 이상 보관되거나, 희석된 상태로 오래 보관된 시약

   <Discussion>

     1. 같은 농도여도 오래 보관된 시약(old)의 증폭 곡선은 new 샘플에 비해 밀리는 것을 확인할 수 있다.

     2. 농도가 낮은 경우,  더 많이 밀리는 것을 확인할 수 있다. 

     3. 고농도 시약을 소분하고  냉동과 해동 과정을 최소화 하는 것이 중요하다고 본다.  (오염 및 변질의 최소화)

5. 주의 사항


5. 주의 사항
    1) 빛에 과하게 노출되지 않도록 조심한다. 

    2) DNA 희석시, 정확한 양을 파이펫팅 하도록 주의한다. 

    3) 혼합된 샘플에 거품이 생기지 않도록 주의한다. 

    4) 오염에 주의한다. 






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