1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
결핵균을 감지하는데 사용되는 중합효소 연쇄반응 분석법이다.
Mycobacterium tuberculosis(MTB) total genom의 Universal한 2부분의 Primer set을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 일으켜 특정부분을 증폭함으로써 결핵의 증폭 여부를 확인한다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
PCR PreMix, Primer set, 결핵균 DNA, Agaroge gel, TAE or TBE buffer, loading dye, DNA ladder (100bp)
| Forward primer 1 | CCT GCG AGC GTA GGC GTC GG |
| Reverse primer 1 | CTC GTC CAG CGC CGC TTC GG |
| Forward primer 2 | TCC GCT GCC AGT CGT CTT CC |
| Reverse primer 2 | GTC CTC GCG AGT CTA GGC CA |
Conventional PCR (ex.DuxCycler-바이오메듀스,한국)
DNA Electrophoresis (ex.DuxGeldoc- 바이오메듀스,한국)
3. 실험 방법 및 절차
3. 실험 방법 및 절차
1) PCR을 위한 반응 Tube의 조성은 다음과 같다. (검체 1개 기준)
첨가시약 | Tube |
Template DNA | 3 ㎕ |
PCR PreMix | 10 ㎕ |
primer set | 2 ㎕ |
D.W | 5 ㎕ |
합계 | 20 ㎕ |
2) 위 premix, primer set, DW 를 test 할 개수+1 만큼 섞어서 PCR tube 에 17 ㎕ 씩 넣는다.
3) 위 튜브에 임상검체에서 추출한 template DNA 3 ㎕를 첨가한다.
(양성대조군, 음성대조군에는 Positive control DNA, Negative control DNA를 넣어준다.)
4) 각 혼합액 튜브는 30초간 spin down 후, PCR 장치에 넣어 아래와 같이 반응시킨다.
과 정 | 온 도 | 시 간 | cycle 수 |
Pre-Denaturation | 94℃ | 5분 | 1 |
Denaturation | 94℃ | 30초 | 40 |
Annealing/Extension | 65℃ | 1분 |
Final-Extension | 72℃ | 5분 | 1 |
End | 4℃ | | |
4. 실험 결과
4. 실험 결과
5. 주의 사항
5. 주의 사항
1) 실험 도중 DNA나 PCR 시약이 오염되지 않도록 파이펫팅에 주의를 기울인다.
2) 실험 방법 중 온도나 시약 양을 틀리지 않게 주의하여 실험한다.
#결핵 #MTB #DNA # Universal primer #PCR
목차
1.개요 및 목적
2. 실험 재료 및 기기
3. 실험 방법 및 절차
4. 실험 결과
5. 주의 사항
6. 관련 자료
1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
결핵균을 감지하는데 사용되는 중합효소 연쇄반응 분석법이다.
Mycobacterium tuberculosis(MTB) total genom의 Universal한 2부분의 Primer set을 사용하여 중합효소 연쇄반응을 일으켜 특정부분을 증폭함으로써 결핵의 증폭 여부를 확인한다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
PCR PreMix, Primer set, 결핵균 DNA, Agaroge gel, TAE or TBE buffer, loading dye, DNA ladder (100bp)
Conventional PCR (ex.DuxCycler-바이오메듀스,한국)
DNA Electrophoresis (ex.DuxGeldoc- 바이오메듀스,한국)
3. 실험 방법 및 절차
3. 실험 방법 및 절차
1) PCR을 위한 반응 Tube의 조성은 다음과 같다. (검체 1개 기준)
첨가시약
Tube
Template DNA
3 ㎕
PCR PreMix
10 ㎕
primer set
2 ㎕
D.W
5 ㎕
합계
20 ㎕
2) 위 premix, primer set, DW 를 test 할 개수+1 만큼 섞어서 PCR tube 에 17 ㎕ 씩 넣는다.
3) 위 튜브에 임상검체에서 추출한 template DNA 3 ㎕를 첨가한다.
(양성대조군, 음성대조군에는 Positive control DNA, Negative control DNA를 넣어준다.)
4) 각 혼합액 튜브는 30초간 spin down 후, PCR 장치에 넣어 아래와 같이 반응시킨다.
과 정
온 도
시 간
cycle 수
Pre-Denaturation
94℃
5분
1
Denaturation
94℃
30초
40
Annealing/Extension
65℃
1분
Final-Extension
72℃
5분
1
End
4℃
4. 실험 결과
4. 실험 결과
5. 주의 사항
5. 주의 사항
1) 실험 도중 DNA나 PCR 시약이 오염되지 않도록 파이펫팅에 주의를 기울인다.
2) 실험 방법 중 온도나 시약 양을 틀리지 않게 주의하여 실험한다.
#결핵 #MTB #DNA # Universal primer #PCR