[PCR]ACE 유전자 검사

백종희
2022-09-28
조회수 1042

목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항

6. 관련 자료


1. 개요 및 목적

1998년 5월 Nature에 인간의 지구력에 강하게 영향을 미치는 유전자 ACE(Angiotensin converting enzyme)를 생산하는 유전자가 보고되었다. ACE는 레닌(rennin)의 도움으로 안지오텐시노겐(angiotensinogen)을 안지오텐신(angiotensin)으로 되었을 때, 안지오텐신을 활성화시키는 효소로 혈관을 수축시키고, 혈압을 상승시키는 작용을 한다. ACE는 안지오텐신(angiotensin) I을 절단하여 강한 혈압상승 작용을 나타내는 안지오텐신(angiotensin) II를 활성화시키는 한편, 혈압강하 작용을 갖는 브라디키닌(bradykinin)을 분해함으로써 고혈압의 원인이 되는 효소인데, 이 효소에 대한 저해물질은 혈압강하 작용을 나타내게 된다.

 ACE 검사는 혈액 속 안지오텐신변환효소(ACE)의양을 측정하는 것으로 ACE는 혈압을 조절하는효소로 안지오텐신 I(불활성단백질)을 안지오텐신 II로 전환시키는 것을 도와준다. 안지오텐신 II는 강한 혈관 수축제로서 기능을 하고 안지오텐신 II는 혈관이 수축되게 하는데, 이것은 혈관을 일시적으로 좁게 만들어 그 곳을 지나가는 혈액 흐름의 압력을 증가시킨다. ACE enzyme을 생성하는 ACE 유전자는 그 type에 따라 II, ID, DD의 세 가지로 나뉜다.

 ACE는 신체 운동에서 지구력과 관련이 있는 것으로 보고되어 지구력이 강한 순서는 II>ID>DD타입이며 DD는 II보다 2배 많은 것으로 조사되고 있다. 8,000M급 이상을 무산소 등정한 영국의 산악인 25명을 대상으로 ACE유전자 검사를 한 결과 모두 II, ID 타입으로 조사되었다. 또한 영국 군대 신병 78명을 대상으로 무거운 바벨을 들고 오래 버티는 훈련을 10주간 실시한 결과 II, ID 타입은 80초 증가했으나 type DD에서는 7초 증가하는데 그쳤다. 또한 심근경색이나 심장마비, 남성 고혈압 환자 그룹에서 type DD이 많은 경향이 있는 것으로 조사되고 있다.

 본 실험은 자신의 ACE 유전자 type을 검사하는 실험으로 이 실험을 통헤 구강세포에서의 DNA추출법과 PCR 및 전기영동 실험 과정을 학습할 수 있다.


2. 실험 재료 및 기기

- 프라이머, 프로브 서열 정보

※ ACE 유전자 증폭

실험 기구

실험 소모품

∙ Micropipette set

∙ Microcentrifuge

∙ Heating block

∙ PCR기계

∙ 전기영동장치

∙ UV-Transilluminator

∙ 구강상피세포에서 추출한 DNA

∙ ACE gene primer

Foreward primer (5′-CTG GAG ACC ACT CCC ATC CTT TCT-3′)

Reverse primer (5′-GAT GTG GCC ATC ACA TTC GTC AGA T-3′)

∙ PCR Master Mix tube(PCR-tube에 dNTP, Taq, buffer, 전기영동용 loading dye가 섞여 있음)

∙ 멸균수 ∙ 피펫팁세트 ∙ 파라필름 ∙ 아가로즈 ∙ TBE buffer

∙ gel-red ∙ DNA Size Marker(100bp ladder) ∙ E-tube


☞ 사람의 염색체 17q 23에 위치하고 있는 ACE gene 중에서 Intron 16에 있는 287bp가 있거나 없는 Insertion/Deletion polymorphic 부위를 PCR을 이용하여 증폭한다.


3. 실험 방법 및 절차


가. 구강세포 DNA 추출

1) 네임펜으로 1.5-mL tube와 종이컵에 이름을 쓴다.

2) 입안을 물로 가볍게 헹군 후 약 10mL의 물을 입안에 넣고 격렬하게(구강상피를 이로 약하게 긁으며) 약 40초간 세척한 뒤 종이컵에 다시 받는다.

3) 구강세척액을 마이크로피펫을 사용하여 1.5mL tube에 1500uL 넣는다.(750uL씩 2회)

4) tube를 microcentrifuge에 무게중심을 맞추어 넣고 60초간 최고속(13,500RPM)으로 돌린다.

5) 상등액을 쏟아내고 튜브 바닥의 pellet(세포덩이)의 크기가 쌀알 크기 이상이면 빈 튜브를 다시 한번 최고속으로 10초간 돌려서 튜브벽의 침액을 튜브 바닥으로 모아 사용하던 마이크로피펫팁을 이용하여 pellet(세포덩이) 주변의 액체를 최대한 제거하여 pellet만 남게 하며 pellet의 크기가 적을 때는 과정 3번에서 5번까지의 작업을 반복한다.

6) 튜브에 Chelex®를 120uL넣고 200uL마이크로피펫을 100uL로 맞추고 in and out pipetting 하여 pellet이 분쇄되도록 하여 구강세포 현탁액을 만든다.

7) 튜브 캡을 닫은 후 동동이(floating rack)에 끼워서 boiling water bath(또는 히팅블록)로 100℃ 10분간 끓인다.

8) 끓인 후 tube를 약 5초간 볼텍싱하고, 아이스에 1분간 정치했다가 microcentrifuge에 60초간 최고속(13,500rpm)으로 원심분리한다.

9) 원심분리하는 동안 최종 DNA용액을 옮길 새 1.5mL 튜브에 이름을 쓴다.

10) 새 마이크로피펫팁을 사용하여 맑은 상등액을 30uL 정도만 준비한 1.5mL tube로 옮긴다. 이때 세포 파편이나 Chelex® 알갱이가 들어가지 않도록 주의한다.

11) DNA용액을 사용할 때 까지 아이스나 냉동실에 보관한다.


나. 중합효소 연쇄반응 (PCR, Polymerase chain reaction)

 * 20uL PCR Master Mix tube(dNTP, Taq, buffer, loading dye 혼합)를 이용할 경우

☞ tube에 PCR에 필요한 주형DNA와 primer, 멸균증류수 이외의 모든 시료가 모두 바닥에 건조 상태의 청색 고형물로 붙어 있음.

1) 멸균증류수 17uL, primer(F와 R)를 각각 1uL씩, 주형 DNA 1uL 넣음(total 20uL)



 

실험 팁(TIP)

 

 

 

 

 

 

만약, 10명이 실험한다면 PCR에 필요한 각자의 주형DNA만을 제외한 나머지 10인분의 PCR primix를 E-tube에 한꺼번에 만들어 사용하는 것이 좋음. 이때 1명 분의 여분을 두어 멸균수 181uL, F-primer 11uL, R-primer 11uL을 넣고 혼합 한 뒤 각 PCR tube에 19uL씩 분배.


2) tube 바닥의 푸른색 시료가 다 녹을 때 까지 약한 tapping으로 잘 녹이고

3) 시료액을 tube바닥으로 모은 뒤 PCR 기계에 넣는다.

4) 각자 자신의 PCR 시료를 제작한다.


 

 

실험 팁(TIP)

 

 

 

 

 

 

Primer가 포함된 PCR primix 19uL + 자신의 주형 DNA 1uL


5) PCR 수행 (약 1시간 반 소요)

thermocycle 조건

Stage

Cycle

Step

온도

시간

1

1

1

94℃

3 분

2

35

1

94℃

30 초

2

55℃

30 초

3

72℃

30 초

3

1

1

72℃

5 분

2

4℃

Hold

 6) 전기영동


4. 실험 결과와 결과의 해석

유전자 사이의 반복되는 염기서열 길이는 개인에 따라 상동염색체 상에서 두 개가 모두 긴 사람(II, 490bp), 두 개가 모두 짧은 사람(DD, 190bp), 짧은 것과 긴 것을 하나씩 갖는 사람(DI)이 있을 수 있으므로 DNA 증폭 후 나타나는 DNA 밴드 패턴은 다음과 같은 3가지로 구분될 것이다.

ACE 유전자 유형

 학생 A : II

학생 B : DD

학생 C : ID

5. 주의 사항

6. 관련 자료, 참고 논문




(작성자 연락처) 백종희 010-7446-7344

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