[Real Time PCR]#21 VRE(VanA, VanB) 증폭 실험

김민지
2022-03-18
조회수 896

목차

1.개요 및 목적

2. 실험 재료 및 기기

3. 실험 방법 및 절차

4. 실험 결과

5. 주의 사항


1. 개요 및 목적

VRE (반코마이신 내성 장알균)은 항생제 반코마이신에 대한 내성이 생기면서 발생되는데 전염성이 높은 감염병중 하나이다.

VRE (반코마이신)에 내성을 보이는 대표적인 장알균으로는 E. faecium(VanA) 와 E. faecalis(VanB)가 있다. VanA와 VanB의 DNA를 가지고 GeneProof사의 VRE PCR Kit를 이용해 실험을 통하여 증폭 여부를 확인한다.


2. 실험 재료 및 기기

실험재료

- GeneProof VRE PCR Kit, VanA & VanB DNA, dH2O


실험기기

- Real Time PCR System (ex. QuantStudio5 - ABI, Thermo Fisher Scientific, USA)


3. 실험 방법 및 절차

① VanA & VanB DNA를 10배씩 희석한다.


Sample 1 (100 copies/uL)Sample 2 (10 copies/uL)Sample 3 (1 copies/uL)
DNAVan A 2 uLSample 1 DNA
2 uL
Sample 2 DNA
2 uL
Van B 2 uL
dH2O16 uL18 uL18 uL
Total20uL20 uL20 uL




② PCR 샘플 시약 조성


Sample 1~3N.C.
Master Mix*30 uL30 uL
Internal Standard**1 uL1 uL
DNA9 uL-
dH2O-9 uL
Total40 uL40 uL

* Master Mix에 Primer와 Probe가 포함되어 있다.

**키트 내에 있는 Internal Standard를 추출 시 샘플에 넣어 사용하지만, 추출하지 않는 경우에는 DNA 9 uL, Internal Standard 1 uL를 넣어 PCR을 진행한다.


4. 실험 결과와 결과의 해석

- Sample 1 (100 copies/uL)의 결과 그래프

 

- Sample 2 (10 copies/uL)의 결과 그래프

- Sample 3 (1 copies/uL)의 결과 그래프

- N.C. 결과 그래프

  • Van A의 경우 FAM에서 증폭을 확인 했고, Van B는 Cy5에서 증폭이 되었음을 확인 했다.
  • IS (Internal Standard)의 경우 HEX에서 증폭을 확인 했다.


5. 주의 사항

① Real time PCR 돌릴 때, multi PCR 이므로 각 타겟에 맞는 형광을 선택을 해야한다.

② DNA를 희석할 때, 정확한 양을 파이펫으로 옮겨서 희석을 하도록 주의한다.

③ 시약의 유효기간을 확인한 뒤 실험한다.

④ 실험 시 오염에 주의하며 진행한다.



* 본 실험에 사용 된 Kit는 GeneProof의 VRE PCR Kit를 사용했습니다.



김민지

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