1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
앞의 실험에서 진행한 Chlamydia trachomatis(CT)와 Neisseia gonorrhoeae(NG)의 DNA를 갖고 *Multiplex PCR 실험을 통해 한 실험에서 두 개의 DNA를 동시에 증폭시켜 본다.
*Multiplex PCR이란?? Multiplex란 1개의 샘플에서 2-4개의 타겟들을 검출하는 기법을 의미한다. Real time PCR의 경우는 Probe에 형광물질을 각각 다르게 하여서 진행하고, Conventional PCR의 경우는 증폭산물의 크기를 다르게 하여 진행한다.
*Multiplex PCR의 사용: Multiplex PCR은 동일한 샘플에서 검출 가능한 다수의 유전자가 있을 경우 유용하게 사용되며, 한번의 검사로 다수의 병원균 및 유전자형을 판별할 수 있어 시간과 비용을 줄일 수 있다. 한번의 검사로 다수의 성병 원인균을 검출할 수 있는 STD 진단키트, HPV 감염 여부 및 유전자형 판별, 결핵균의 감염 여부와 약제 내성을 판별하는데 사용되고 있다. 또한 STR 마커를 이용하여 법의학, 친자 확인 등에도 사용된다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
실험 재료
TaqMan Gene expression master mix, CT&NG Primer set (Forward, Reverse), Probe, CT DNA, NG DNA, dH2O
CT_F: GCGGGCGATTTGCCTTA
CT_R: CGGTCAACGAAGAGGTTTTGTC
NG_F: CCTTTGGTCTTGGTTTCCAACA
NG_R: TCATAGCGATATGGAGCGTCAA
CT_P: CGGAGCGAGTTACG-**FAM
NG_P: CTCTGCTTCGGCTCT-**HEX
**Real time PCR 장비는 기본적으로 다양한 파장대의 형광값을 실시간으로 측정하여 결과로 나타내는 방식이다. Multiplex PCR은 이를 토대로 파장의 범위 별로 다른 형광을 종류별로 정해 각 타켓의 Probe에 붙여주는 것이다.
파장예시 표:
Filter | 흡수 파장 | 방출 파장 | 형광 |
---|
1 | 490nm | 520nm | FAM, SYBR Green Ⅰ |
2 | 520nm | 550nm |
|
3 | 550nm | 580nm |
|
4 | 580nm | 610nm |
|
5 | 630nm | 680nm |
|
실험 기기
Real time PCR Machine (QuantStudio5, ABI, Thermo Fisher Scientific, 미국)
3. 실험 방법 및 절차
3. 실험 방법 및 절차
① CT&NG DNA를 10배씩 희석하여 준비한다.
| Sample 1 | Sample 2 | Sample 3 | Sample 4 | Sample 5 |
---|
DNA | CT 2uL | Sample 1의 DNA 2uL | Sample 2의 DNA 2uL | Sample 3의 DNA 2uL | Sample 4의 DNA 2uL |
NG 2uL |
dH2O | 16uL | 18uL | 18uL | 18uL | 18uL |
Total | 20uL | 20uL | 20uL | 20uL | 20uL |
② PCR 샘플 시약 조성
| Sample 1 ~ 5 | N.C. |
---|
Master Mix | 10uL | 10uL |
Primer Set | 5uL | 5uL |
CT&NG DNA | 3uL | - |
dH2O | 2uL | 5uL |
Total | 20uL | 20uL |
③ PCR 조건에 맞춰 기기를 세팅한다.
단계 | 온도 | 시간 | 사이클 |
---|
UDG Incuvation | 50℃ | 02:00 | 1 |
Pre denature | 95℃ | 10:00 | 1 |
Denature | 95℃ | 00:15 | 40 |
Anneal/Extend | 60℃ | 01:00 |
④ PCR이 끝난 후 그래프를 확인한다.
4. 실험 결과
4. 실험 결과
5. 주의 사항
5. 주의 사항
① 타겟이 여러 개이고 그에 따라 여러 개의 형광을 사용하기 때문에 서로의 형광 파장 때에 영향이 없도록 probe를 디자인하여야 한다.
② Real time PCR 기기로 실험 시 형광을 설정하는데 각 타겟에 알맞은 형광을 잘 선택하여 실수가 없도록 해야 한다.
#Multiplex PCR #FAM #HEX
이경진 연구원
경기도 수원시 영통구 대학4로 17 (이의동) 에이스광교타워1 3층 308호
Tel.(+82)031-899-8620 Fax.(+82)031-899-8621
E-mail.biomedux@biomedux.com
목차
1.개요 및 목적
2. 실험 재료 및 기기
3. 실험 방법 및 절차
4. 실험 결과
5. 주의 사항
1. 개요 및 목적
1. 개요 및 목적
앞의 실험에서 진행한 Chlamydia trachomatis(CT)와 Neisseia gonorrhoeae(NG)의 DNA를 갖고 *Multiplex PCR 실험을 통해 한 실험에서 두 개의 DNA를 동시에 증폭시켜 본다.
*Multiplex PCR이란?? Multiplex란 1개의 샘플에서 2-4개의 타겟들을 검출하는 기법을 의미한다. Real time PCR의 경우는 Probe에 형광물질을 각각 다르게 하여서 진행하고, Conventional PCR의 경우는 증폭산물의 크기를 다르게 하여 진행한다.
*Multiplex PCR의 사용: Multiplex PCR은 동일한 샘플에서 검출 가능한 다수의 유전자가 있을 경우 유용하게 사용되며, 한번의 검사로 다수의 병원균 및 유전자형을 판별할 수 있어 시간과 비용을 줄일 수 있다. 한번의 검사로 다수의 성병 원인균을 검출할 수 있는 STD 진단키트, HPV 감염 여부 및 유전자형 판별, 결핵균의 감염 여부와 약제 내성을 판별하는데 사용되고 있다. 또한 STR 마커를 이용하여 법의학, 친자 확인 등에도 사용된다.
2.실험 재료 및 기기
2. 실험 재료 및 기기
실험 재료
TaqMan Gene expression master mix, CT&NG Primer set (Forward, Reverse), Probe, CT DNA, NG DNA, dH2O
CT_F: GCGGGCGATTTGCCTTA
CT_R: CGGTCAACGAAGAGGTTTTGTC
NG_F: CCTTTGGTCTTGGTTTCCAACA
NG_R: TCATAGCGATATGGAGCGTCAA
CT_P: CGGAGCGAGTTACG-**FAM
NG_P: CTCTGCTTCGGCTCT-**HEX
**Real time PCR 장비는 기본적으로 다양한 파장대의 형광값을 실시간으로 측정하여 결과로 나타내는 방식이다. Multiplex PCR은 이를 토대로 파장의 범위 별로 다른 형광을 종류별로 정해 각 타켓의 Probe에 붙여주는 것이다.
파장예시 표:
실험 기기
Real time PCR Machine (QuantStudio5, ABI, Thermo Fisher Scientific, 미국)
3. 실험 방법 및 절차
3. 실험 방법 및 절차
① CT&NG DNA를 10배씩 희석하여 준비한다.
② PCR 샘플 시약 조성
③ PCR 조건에 맞춰 기기를 세팅한다.
④ PCR이 끝난 후 그래프를 확인한다.
4. 실험 결과
4. 실험 결과
5. 주의 사항
5. 주의 사항
① 타겟이 여러 개이고 그에 따라 여러 개의 형광을 사용하기 때문에 서로의 형광 파장 때에 영향이 없도록 probe를 디자인하여야 한다.
② Real time PCR 기기로 실험 시 형광을 설정하는데 각 타겟에 알맞은 형광을 잘 선택하여 실수가 없도록 해야 한다.
#Multiplex PCR #FAM #HEX
이경진 연구원
경기도 수원시 영통구 대학4로 17 (이의동) 에이스광교타워1 3층 308호
Tel.(+82)031-899-8620 Fax.(+82)031-899-8621
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